Introdução a demanda por produtos de alta qual...introdução a demanda por produtos de alta qualidade, imprimiu um caráter muito mais dinâmico ao já disputado mercado químico, farmacêutico e alimentício. esta, acirrada competitividade se refletiu diretamente nos processos industriais, uma vez que a qualidade do produto está inevitavelmente associada à tecnologia empregada na sua produção. fenômenos que antes eram desprezados e procedimentos que não se justificavam tornaram-se focos da atenção, motivando investimentos consideráveis em ciência e tecnologia. em geral, métodos biocatalíticos de síntese de ésteres são preferíveis quando comparados com métodos químicos convencionais. a síntese enzimática envolvendo lipases apresenta diversas vantagens, pois pode garantir maiores rendimentos em reações com temperaturas próximas da temperatura ambiente, dependendo da metodologia e da enzima aplicadas, o que proporciona produtos de qualidade, com economia de energia e ausência ou reduzida ocorrência de subprodutos. o uso de lipases nas indústrias permite o desenvolvimento de processos tecnológicos muito próximos aos eficientes processos executados pela natureza. a economia de energia e minimização da degradação térmica são provavelmente as maiores vantagens na substituição de tecnologias químicas convencionais pelas biológicas. atualmente, observa-se a preferência de consumo de alimentos que contêm em sua formulação ingredientes naturais, em substituição aos aditivos químicos, o que faz com que esses produtos tenham apelo de mercado diferenciado. compostos obtidos por catálise enzimática ou por ação microbiana podem ser considerados naturais, fato que promove grande aceitação por parte do consumidor, agregando, dessa forma, maior valor aos produtos que utilizam esses bioprodutos produzidos biotecnologicamente. ésteres obtidos por via enzimática têm sido muito valorizados devido à sua obtenção em condições brandas, à alta eficiência catalítica e à alta seletividade dos catalisadores, podendo ser considerados produtos naturais. com base nestes aspectos, a possibilidade de aplicação das enzimas como catalisadores de reações de interesse utilizando diferentes sistemas reacionais e o nanoenpasulamento em polímeros biocompatíveis apresenta potencial de avaliação do ponto de vista científico e tecnológico, justificando a presente proposta. neste contexto, vislumbra-se como objetivo geral desta proposta o desenvolvimento de tecnologia de produção de ésteres bioativos naturais por esterificação enzimática utilizando reatores em modo batelada e contínuo, encapsulamento dos ésteres pelas técnicas de nano emulsificação e nanopartículas lipídicas sólidas, bem como, o estudo da atividade biológica. tendo como objetivos específicos: • avaliar a síntese de ésteres utilizando lipases imobilizadas home-made e comerciais; • avaliar a reação de esterificação de diferentes substratos com e sem a adição de solvente em modo batelada e/ou contínuo, através do estudo do efeito das variáveis de processo (temperatura, razão molar, concentração de enzima e tempo de reação) sobre a conversão de ésteres, bem como, a obtenção da cinética dos componentes do meio reacional nas condições estudadas; • aprimoramento de metodologias para análise quantitativa dos produtos da reação; • estudar a eficiência da reação de esterificação enzimática em diferentes sistemas reacionais: agitação orbital e ultrassom em modo batelada; • avaliar o encapsulamento dos ésteres utilizando diferentes métodos de encapsulação como a técnica de nano emulsificação (ne) e nanopartículas lipídicas sólidas (nls); • analisar a morfologia das partículas carregadas com ésteres obtidos pelos diferentes métodos de encapsulação (nano emulsificação e nanopartículas lipídicas sólidas); • avaliar a liberação in vitro dos ésteres encapsulados pelas técnicas de nano emulsificação e nanopartículas lipídicas sólidas; • avaliar da atividade biológica dos ésteres produzidos livres e encapsulados in vivo (atividade antimicrobiana e larvicida); • estabelecer competências e geração de habilidades entre as equipes participantes da proposta, para a formação de recursos humanos especializados em todo o processo de produção de ésteres bioativos. em consonância com os objetivos específicos da presente proposta será utilizada para a produção, encapsulamento e atividade biológica a metodologia descrita a seguir. metodologia serão testadas as lipases home-made imobilizadas de origem microbiana e vegetal. além, de lipases comerciais imobilizadas, como a novozym 435, a lipozyme rm im e lipozyme tl im. produção enzimática de ésteres em modo batelada e contínuo serão utilizados neste trabalho diferentes substratos. a síntese será realizada preparando uma mistura reacional. a determinação da conversão será realizada por cromatografia gasosa, equipado com detector fid. para determinação das condições experimentais que maximizem a síntese de ésteres, resultantes da reação de esterificação, será realizado pela estratégia de planejamento experimental sequencial. as variáveis estudadas nesta etapa serão: tempo, temperatura, razão molar álcool:acil doador, agitação e concentração de enzima. as reações de esterificação enzimática serão realizadas em modo contínuo e em batelada em shaker com agitação orbital ou banho de ultrassom (frequência de 45 khz e potência de 132 w). com os resultados obtidos nos planejamentos de experimentos, uma avaliação cinética da reação será realizada adotando a melhor condição encontrada no estudo. preparo da nano emulsão as formulações das nano emulsões serão constituídas por crodamol gtcc, um lipídio liquido ultra hidrofóbico utilizado para auxiliar na estabilidade das emulsões, pluronic f-127 como surfactante hlb 22 usado para evitar a coalescência das formulações e posterior desestabilização e éstere purificado obtido pela síntese enzimática. todas as nano emulsões preparadas serão mantidas a temperatura de 10 ± 2 ºc e a estabilidade das amostras será avaliada do dia 0 a 60 dias após a preparação. preparação das nanopartículas lipídicas sólidas a preparação das nanopartículas lipídicas sólidas será realizada com o mesmo lipídio liquido crodamol gtcc e surfactante pluronic f-127. com a adição do ácido graxo escolhido para a matriz lipídica das partículas, ácido esteárico. o éster será encapsulado em nanopartículas lipídicas sólidas (nls) pela técnica de homogeneização a quente em ultrassom. diâmetro médio (dp) e índice de polidispersão (pdi) a distribuição do diâmetro das partículas e o índice de polidispersão serão determinados pela técnica de espectroscopia de correlação de fótons ou espalhamento dinâmico de luz utilizando o equipamento zetasizer nano zs zen3600 (ângulo do feixe incidente de 173° e comprimento de onda do laser de 633 nm), da malvern instruments. morfologia das partículas a caracterização morfológica das nanopartículas lipídicas sólidas será feita pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão (met) com voltagem máxima de aceleração de 100 kv e faixa de magnificação de 50 a 600.000 vezes. eficiência de encapsulação das nanopartículas lípidicas sólidas a eficiência de encapsulação do éster benzílico em nanopartículas lipídicas sólidas será determinada por centrifugação utilizando filtros com membranas de massa molecular de 100 kda. a análise será realizada adicionando 500 ?l da dispersão de nls no filtro amicon® ultra em o filtro à centrifugação a 10000 rpm for 20 min. as nls carregadas ficarão retidas no filtro, a água e o éster livre serão permeados pela membrana. uma alíquota do permeado será diluída em etanol e o éster livre será quantificado por espectroscopia de uv/vis a 272 nm utilizando espectrofotômetro hitachi (u-1900). estudos de liberação das nanopartículas lipídicas sólidas os ensaios de liberação serão realizados utilizando uma membrana de diálise (mwco 10 kda, spectra pore). a membrana será embebida em água destilada durante 24 h e preenchida com 1 ml da formulação seguido por incubação em 30 ml de tampão de fosfato 10 mm (ph 7,4) com etanol a 10% (v/v), água a ph 5,6 a temperatura de 37 °c. alíquotas de 2 ml serão retiradas a cada 1 h e a concentração do éster benzílico será medida a 272 nm utilizando um espectrofotômetro uv-vis. em seguida, o frasco será reabastecido com 2 ml para manter volume do meio de liberação constante. atividade biológica dos ésteres benzílicos produzidos os ésteres benzílicos serão avaliados quanto as suas propriedades funcionais por sua atividade antimicrobiana e larvicida. os dados de cada ensaio será a média de três determinações de três experimentos independentes.