O câncer de colo uterino é o segundo tipo de câ...o câncer de colo uterino é o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres e a terceira causa de morte em países menos desenvolvidos. em 2012 estimou-se um aumento de 527.600 novos casos com 265.700 mortes por esse câncer no mundo. a áfrica, américa latina, caribe e melanésia fazem parte das áreas de maior incidência mundial. (torre et al. 2015) objetivo geral: realizar uma análise multimodal das atipias do colo uterino utilizando métodos tais como a citometria do dna (dna-icm), imunocitoquímica, teste de hpv, agnor e hibridização in situ por fluorescência (fish). objetivos específicos: . avaliar a ploidia do dna nas células atípicas; . analisar a positividade dos anticorpos anti-ki67, anti-p53 e anti p16ink4a; . analisar a associação entre os graus de atipias identificados nas células cervicais e a presença do hpv detectada por pcr e captura híbrida e sua genotipagem; . identificar os subtipos de hpv de alto risco mais prevalentes no nosso meio; . analisar a hiperexpressão das regiões nucleolares por prata (agnor) nas células atípicas; . identificar alterações cromossomais em células atípicas por hibridização in situ por fluorescência . fazer uma análise comparativa multimodal em predizer o risco de gravidade das lesões; . identificar os sinais/achados colposcópicos mais importantes numa análise conjunta com a ploidia do dna em predizer o risco de gravidade das lesões. materiais e métodos / metodologia: será realizado um estudo prospectivo transversal, envolvendo mulheres que serão atendidas no ambulatório de ginecologia e colposcopia do hospital universitário da ufsc, que apresentarem alterações citológicas na colpocitologia oncótica. o estudo será realizado de julho de 2016 a abril de 2019. este trabalho será submetido ao comitê de ética em pesquisa (cep) do hu-ufsc. toda paciente que se enquadra nos critérios de inclusão será previamente convidada a participar do estudo e informada acerca da pesquisa. aquelas que aceitarem participar assinarão um termo de consentimento livre e esclarecido (tcle) e posteriormente, responderão a um questionário (anexo). ao assinar o tcle, os resultados laboratoriais e clínicos rotineiramente realizados serão obtidos e incluídos na pesquisa. critérios de inclusão: todas as pacientes que apresentarem algum tipo de alteração citológica no citopatológico do colo uterino e aceitarem participar do estudo. critérios de exclusão: aquelas mulheres que estiverem grávidas no momento do exame ou menores de 18 anos. coleta e processamento: as mulheres selecionadas serão submetidas a exame ginecológico e colposcopia. no momento do exame serão coletadas amostras citológicas com espátula de ayre e escova endocervical para a execução de citologia em base líquida. as amostras serão armazenadas em solução preservcyt ® thinprep e posteriormente processadas em citocentrífuga para confecção das lâminas. serão confeccionadas lâminas para exame de papanicolaou, análise de dna, agnor e fish. o material armazenado em solução preservcyt ® thinprep será utilizado também para o teste de hpv por pcr e captura híbrida. será realizada biópsia nas lesões evidenciadas na colposcopia como é feito na rotina de acordo com o estabelecido pelo ministério da saúde. o exame histopatológico é realizado rotineiramente pelo setor de patologia do hu-ufsc. o laudo colposcópico utilizará a terminologia da ifcpc (international federation for cervical pathology and colposcopy) – rio de janeiro 2011. colposcopia: o colposcópio utilizado será da marca medpej, modelo pe 7000, com objetiva de alta resolução com distância focal de 300 ou 400 mm; aumento variável em 3 opções: 07,14 e 25. o exame iniciará com observação direta do colo e mucosas após limpeza do muco. solução de ácido acético a 3% será aplicada sobre a cérvice e vagina com spray. essa solução quase não tem ação no epitélio escamoso normal bem diferenciado, no entanto promove a coagulação das proteínas intracelulares epiteliais reduzindo a transparência dos epitélios metaplásicos e anormais, fato responsável pelo característico efeito de aceto-branqueamento em diferentes graus conforme a densidade nuclear. em seguida será realizado o teste de schiller onde a solução de lugol será captada pelas células da camada intermediária do epitélio pavimentoso normal ricas em glicogênio, assumindo uma cor marrom avermelhada escura. o epitélio metaplásico, o pré neoplásico e o neoplásico, por serem desprovidos de glicogênio não se coram ficando iodo negativos. o teste será iodo positivo (schiller negativo) quando o epitélio se cora em marrom escuro; será iodo negativo (schiller positivo) quando a área não se cora e iodo parcialmente positivo quando existe captação parcial do iodo. é considerado um teste bastante inespecífico, pois células neoplásicas, glandulares, em maturação e áreas de espessamento e de erosão podem ser iodo negativas, mas pode ser útil para delimitar margens das lesões cervicais. as biópsia dirigidas serão realizadas por meio de pinças tipo saca bocados como a gaylor-medina. a hemostasia será realizada com percloreto férrico (solução hemostática) e tampão vaginal, caso haja necessidade. os achados colposcópicos anormais do colo uterino serão identificados em grau menor (epitélio acetobranco tênue, de borda irregular ou geométrica, mosaico e pontilhado finos), grau maior (epitélio acetobranco denso, orifícios glandulares espessados, mosaico e pontilhado grosseiros, sinal da margem interna, sinal da crista ou sobrelevado) e suspeita de invasão (vasos atípicos e frágeis, superfície irregular, lesão exofítica, necrose, ulceração, neoplasia tumoral/grosseira) (tatti, bornstein et al. 2013, zlatkov and kostova 2014). imunohistoquímica: as reações serão realizadas em lâminas revestidas com silano (sigma, st. louis, mo, eua) desparafinadas, re-hidratadas e tratadas em peróxido de hidrogénio a 3% em metanol durante 10 minutos para eliminação da atividade da peroxidase endógena. o método avidina biotina será utilizado para imunomarcação. as secções de tecido serão incubadas sequencialmente “overnight” à temperatura ambiente com os anticorpos primários: anticorpo monoclonal anti-ki67 (dako, carpinteria, ca, eua), anticorpo monoclonal anti-p53 (1/10 - santa cruz, biotechnology, inc-ca-eua) e anticorpo monoclonal anti p16ink4a (1/250 - santa cruz, biotecnologia, inc-ca-eua). um anticorpo secundário biotinilado multiligação será aplicado durante 30 minutos seguido por estreptavidina-peroxidase durante 30 min. as lâminas serão contrastadas com hematoxilina durante 1 min, lavadas em água destilada, desidratadas em etanol graduado, limpas com xilol e montadas permanentemente em entellan (merck, darmstadt, alemanha). as células positivas serão quantificadas com o auxílio de um microscópio (leitz) utilizando uma gratícula, inserida na ocular do microscópio, com objetiva de 400x (amaro-filho et al., 2013; nicol et al., 2008). citologia em base líquida as amostras coletadas em solução preservcyt® thinprep serão armazenadas em temperatura ambiente pelo período de até seis semanas antes do processamento. as lâminas citológicas serão preparadas com o sistema de citocentrífuga semi-automatizado tharmac que, através de um processo de dispersão, separa sangue, muco, detritos não diagnósticos e homogeneiza a amostra de células. estas são coletadas em filtro de maneira a criar uma fina camada celular satisfatória e sem sobreposições celulares que é transferida então para uma lâmina de vidro num círculo com 20mm de diâmetro (cibas, ducatman, 2009; cytyc corporation, 2007). as lâminas serão submetidas à coloração pelo método clássico de papanicolau e examinadas por meio de microscopia de luz em busca de mudanças morfológicas e morfométricas sofridas pela estrutura celular. suas alterações serão classificadas utilizando-se a nomenclatura do sistema bethesda 2001 (bragagnolo et al., 2010; longatto-filho et al., 2005). citometria de dna após análise citológica, as lamínulas das lâminas coradas por papanicolaou serão removidas (imersão no xilol), para posterior coloração de feulgen. serão selecionadas no mínimo 30 células de referência (células intermediárias) para cada lâmina. as células de referências são o ponto de partida para o reescalonamento das medições densitométricas. servirão como padrão interno da própria lâmina para as células de análise. o coeficiente de variação entre as células de referência não pode passar de 5% (böcking; huy nguyen, 2004). mais de 300 células de análise para cada lâmina serão selecionadas, de forma geral, randomicamente. entretanto, células com significância diagnóstica, ou seja, com morfologia suspeita (núcleo aumentado, coloração mais forte), serão arbitrariamente incluídas na análise devido sua relevância. a interpretação dos resultados através dos complexos algoritmos preconizados pela esacp serão realizados automaticamente pelo software da moticyte dna cytology work station (motic®). teste de hpv: reação em cadeia de polimerase (pcr)