A crista neural (cn) é uma estrutura presente n...a crista neural (cn) é uma estrutura presente no início do desenvolvimento embrionário de vertebrados e consiste em uma população de células progenitoras multipotentes e com habilidades migratórias que emergem do tubo neural (tn). estas células seguem em direção aos seus destinos finais e podem tornar-se neurônios, células gliais, fibroblastos, melanócitos, adipócitos ou originar derivados esqueléticos como cartilagem e osso. os precursores da crista neural cefálica (cnc) e truncal (cnt) correspondem às células em diferentes estados de comprometimento. embora sejam majoritariamente multipotentes, alguns grupos de células deixam o tn parcial ou totalmente comprometidos, a saber, possuem seu potencial restrito a poucos ou um tipo celular específico. in vivo, as células da cnc diferenciam-se em derivados mesenquimais às expensas de neurais, enquanto na cnt o oposto acontece. elucidações de cunho evolutivo têm demonstrado que no passado, a cnc era distribuída ao longo de todo eixo rostro-caudal do embrião, isto pode ser evidenciado através da estrutura esquelética de alguns peixes fósseis contendo dentina, tecido sabidamente derivado da cn. com o surgimento do endoesqueleto, estrutura derivada da mesoderme, este potencial mesenquimal foi silenciado. nos vertebrados atuais, as células da cnc que migram para o primeiro arco branquial a fim de formar os elementos craniofaciais de aves e mamíferos configuram-se como um resquício evolutivo daquele progenitor multipotente. no entanto, se devidamente estimuladas in vitro, as células da cnt podem “despertar” seu potencial latente gerando fenótipos mesenquimais como adipócitos, osteócitos e condrócitos. apenas é possível saber se determinada célula é multipotente, parcialmente multipotente ou totalmente comprometida a determinado fenótipo, submetendo-a a condições ambientais que permitam que seus potenciais se desenvolvam plenamente. para esta análise, são necessárias culturas clonais, onde uma célula é semeada por poço e suas capacidades de auto-renovação e multipotencialidade - dois requisitos para uma célula ser designada tronco - podem ser analisadas. através deste método de estudo um progenitor altamente multipotente capaz de dar origem a células gliais (g), neurônios (n), melanócitos (m), fibroblastos (f), cartilagem ( c) e osteoblastos (o) (progenitor gnmfco) foi descrito em cultivos da cnc. além disso, os progenitores considerados células tronco (multipotentes e auto-renovantes) gm e gf também foram identificados desta forma.diversos trabalhos - inclusive do nosso grupo de pesquisa - já utilizaram diferentes substratos como puramatrix, matrigel e 3t3, para investigar de que maneira estes atuariam no desenvolvimento das potencialidades da cnt. através do cultivo sobre matrigel soube-se que células da cn se diferenciam em nódulos de cartilagem preferencialmente em ambientes 3d. o cultivo celular sobre puramatrix revelou que o potencial esquelético da cnt é favorecido na concentração de 0,15% de puramatrix. é incessante a busca por novas possibilidades de substratos que possam atuar "imitando" o ambiente in vivo ao qual as células da cnt estão submetidas, na esperança de que estes venham justamente possibilitar que a cnt expresse totalmente o seu potencial. a sinalização de morfógenos como sonic hedgehog (shh) ou fatores de diferenciação mesenquimal (fdm), promovem a expressão do potencial mesenquimal da cnt. através destas moléculas foram obtidos nódulos cartilaginosos, osso e adipócitos, corroborando a importância dos estímulos ambientais na diferenciação das células da cnt em derivados mesenquimatosos. ainda, há outras moléculas conhecidas (e possivelmente algumas ainda não conhecidas) que atuam pronunciando este potencial nas células da cnt. tornando a questão ainda mais fascinante, um emergente corpo de evidências aponta para o papel epigenético na determinação dos destinos de diferenciação da cnt. o dna não se encontra “nu” na célula, antes, está associado com proteínas histonas e a modificação destas, como acetilação e metilação - as duas mudanças mais estudadas em relação à cn, acarretam mudanças na chamada “paisagem epigenética” que pode desencadear determinadas escolhas de destino pelas células da cn às expensas de outras. isso pode ocorrer através de modificações na estrutura da cromatina que reflete diferentes padrões de atividade gênica - por exemplo, a cromatina menos condensada torna-se transcricionalmente mais acessível. neste projeto objetiva-se estudar a regulação epigenética nos progenitores cnt, partindo do pressuposto de que mudanças epigenéticas podem ser uma das fontes principais das alterações evolutivas que desencadearam a latência do potencial mesenquimal das células da cnt. analisaremos se o uso dos já conhecidos inibidores 5-aza-2'-deoxyxytidine (5'd) e trichostatin a, o primeiro promotor da demetilação do dna e o segundo inibidor da deacetilação de histonas, permitem, influenciam ou inibem a escolha de determinados destinos celulares pelas células da cnt. para alcançar estes objetivos, serão excisados os tubos neurais que compreendem a região dos 10 últimos somitos do tronco de embriões de codorna (coturnix coturnix japonica) no estágio de 20 a 24 somitos. estes tubos serão colocados em placas de cultivo de 35mm do em meio básico (alfa-mem) enriquecido com 10% de soro bovino fetal, 2% de extrato de embrião e glutamina. após 15 horas correspondentes ao período de migração, as células serão recuperadas e semeadas em culturas de massa (200 células/poço) em placas de cultura de 96 poços revestidas com matrigel ou puramatrix e submeter-se-á ou não estas culturas aos inibidores 5-aza-2'-deoxycytidine e trichostatin a. tanto a condição controle, quanto a condição tratada serão mantidas em estufa úmida e fixadas após 7 ou 10 dias. após isto, serão realizadas imunocitoquímicas para identificar os fenótipos presentes no cultivo e paralelamente, imunocitoquímicas para detectar regiões do dna e histonas metiladas ou acetiladas. portanto será possível correlacionar os padrões de metilação e acetilação de histonas com os fenótipos da cn obtidos através das culturas. este trabalho é de extrema relevância para a área pois vislumbra compreender a relação existente entre fenômenos epigenéticos, a saber, modificações histônicas e alterações no dna e a escolha de identidade pelas células da cnt. isto pode promover o entendimento de diversos mecanismos celulares e moleculares de diferentes neurocristopatias, fomentar discussões acerca das modificações epigenéticas ao longo da evolução dos vertebrados, bem como contribuir para a obtenção de certos fenótipos celulares.