A sepse tem sido historicamente uma condição de...a sepse tem sido historicamente uma condição de difícil identificação e diagnóstico. é a principal causa de morte em pacientes admitidos em unidades de terapia intensiva. a sepse é uma síndrome complexa que resulta de uma resposta do hospedeiro à patógenos invasores, principalmente bactérias, causando alterações cardiovasculares, imunológicas e metabólicas, com liberação de diversos mediadores inflamatórios, alterações hemodinâmicas e danos em múltiplos órgãos. dentre estes mediadores, o óxido nítrico está diretamente envolvido com o desenvolvimento do colapso cardiovascular, principalmente a refratariedade à vasoconstritores que acontece nos pacientes que evoluem para o quadro choque séptico. o óxido nítrico é o ativador endógeno da enzima guanilato ciclase solúvel. a produção do segundo-mensageiro guanosina 3',5'- monofosfato cíclico (cgmp) pela guanilato cilcase é o mecanismo pelo qual o óxido nítrico exerce a maioria dos seus efeitos. os níveis de cgmp são modulados também pelas fosfodiesterases, enzimas responsáveis pela sua degradação. existem na literatura inúmeros trabalhos que abordam sepse e óxido nítrico, mas escassos estudos relacionam a sepse com a enzima guanilato ciclase e o seu produto o cgmp. além disso, estes poucos trabalhos apresentam resultados contraditórios. isso mostra a complexidade da participação da via guanilato ciclase/cgmp na sepse, havendo, portanto, a necessidade de mais estudos. dessa forma, o presente projeto tem por propósito investigar a via da guanilato ciclase/cgmp na sepse e choque séptico, através de uma abordagem farmacológica inédita para estas enfermidades. avaliaremos o efeito da inibição de diferentes fosfodiesterases sobre as alterações inflamatórias, hemodinâmicas bem como sobre a mortalidade durante a sepse/choque séptico. o aumento do cgmp, em momentos críticos da sepse pode propiciar uma melhor perfusão e consequentemente proteção de órgãos nobres como rim, coração e pulmão que geralmente sofrem de isquemia em momentos inicias. inibidores destas enzimas já tem sido usado com sucesso em outras doenças cardiovasculares como hipertensão pulmonar e insuficiência cardíaca e podem talvez representar uma opção segura, eficaz e economicamente viável para o tratamento da sepse. objetivo portanto, o objetivo desta proposta é avaliar o papel do cgmp em momentos iniciais através de uma abordagem farmacológica alternativa. enquanto os trabalhos da literatura, incluindo os do nosso grupo (fernandes et al., 2006; fernandes et al., 2009), tem estudado o papel do cgmp através da inibição da enzima responsável pela sua produção (guanilato ciclase), o nosso objetivo aqui é inibir a(s) enzima(s) responsável(is) pela sua degradação, as fosfodiesterases. as fosfodiesterases constituem uma família com 11 diferentes membros, disitintas por características enzimáticas, estruturais, perfil de inibição farmacológica e distribuição tecidual (maurice et al., 2014). entretanto o nosso trabalho vai focar nas fosfodiesterases expressas principalmente em tecidos vasculares, a saber as fosfodiesterases 2, 3, 4 e 5 (surapisitchat et al., 2007). cada uma desta enzimas apresenta inibidores farmacológicos seletivos, alguns inclusive usados na clínica como é o caso dos inibidores da fosfodiesterase 5 (maurice et al., 2014). a inibição destas enzimas no início do choque séptico, pode gerar um aumento nos níveis de cgmp, propiciando uma melhor perfusão e consequentemente proteção de órgãos nobres como rim, coração e pulmão que geralmente sofrem de isquemia em momentos inicias. mais especificamente, os objetivos são os seguintes: - avaliar o efeito do tratamento precoce com inibidores de fosfodiesterases (2, 3, 4 e 5) sobre as alterações hemodinâmicas e parâmetros inflamatórios em em um modelo experimental de choque séptico. - avaliar os níveis de cgmp e camp no plasma, urina e tecido de animais em choque séptico tratados ou nao com inibidores de fosfodiesterases (2, 3, 4 e 5). - avaliar o efeito do tratamento precoce com inibidores de fosfodiesterases sobre a mortalidade de animais sépticos. resultados esperados para o projeto espera-se com este trabalho correlacionar alterações nos níveis de cgmp e alterações vasculares que acontecem principalmente nos momentos inicias da sepse. a partir desta compressão será possível modular os níveis cgmp de forma racional, afim de obter melhora na perfusão tecidual e prevenir desta forma a disfunção de órgãos que ocorre na sepse. metodologia para a realização dos experimentos deste projeto, serão empregadas técnicas em uso corrente no laboratório ou em laboratórios associados. algumas destas técnicas incluem: -técnicas bioquímicas: a) dosagem de nitrito e de nitrato por detecção colorimétrica; b) ensaio de atividade enzimática para determinação dos níveis de no sintase; c) análise da presença de nos e de outras proteínas relevantes (guanilato ciclase) por western blotting; d) dosagem de marcadores de dano tecidual (uréia, creatinina, lactato, lipase, creatino-quinase). -técnicas farmacológicas: a) indução de quadros de choque séptico pela metodologia de clp (cecal ligation and puncture; ligação cecal e perfuração); b) montagem de preparações isoladas de musculatura lisa vascular e extravascular para registro de contração ou relaxamento isométrico; c) preparação e registro de pressão arterial em animais de experimentação; d) preparação de coração isolado e perfundido (langendorff); e) parâmetros cardíacos in vivo por cateterismo cardíaco direto; f) medida de fluxo tecidual. cultura de células: a) manutenção de linhagens de células; b) obtenção e cultivo de células de cultura primária de músculo liso e endotélio. -técnicas de microscopia e de biologia molecular: a) imunoeletroforese de proteínas relevantes (nos, guanilato ciclase,); b) real time-pcr (polymerase chain reaction); c) análise de expressão de várias proteínas relevantes por citometria de fluxo e microscopia confocal. referências angus dc, linde-zwirble wt, lidicker j, clermont g, carcillo j, pinsky mr. epidemiology of severe sepsis in the united states: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care sepsis. crit. care med. 29:1303-1310; 2001. fernandes d, sordi r, pacheco lk, nardi gm, heckert bt, villela cg, lobo ar, barja-fidalgo c, assreuy j. late, but not early, inhibition of soluble guanylate cyclase decreases mortality in a rat sepsis model. j pharmacol exp ther. 328(3):991-9, 2009. fernandes d, assreuy j. nitric oxide and vascular reactivity in sepsis. shock. 30 suppl 1:10-3, 2008. fernandes d, da silva-santos je, duma d, villela cg, barja-fidalgo c, assreuy j. nitric oxide-dependent reduction in soluble guanylate cyclase functionality accounts for early lipopolysaccharide-induced changes in vascular reactivity. mol pharmacol. 69(3):983-90, 2006. maurice dh, ke h, ahmad f, wang y, chung j, manganiello vc. advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases. nat rev drug discov. 13(4):290-314, 2014. nardi gm, scheschowitsch k, ammar d, de oliveira sk, arruda tb, assreuy j. neuronal nitric oxide synthase and its interaction with soluble guanylate cyclase is a key factor for the vascular dysfunction of experimental sepsis. crit care med. 42(6):e391-400, 2014. sands ke, bates dw, lanken pn, graman ps, hibberd pl, kahn kl, parsonnet j, panzer r, orav ej, snydman dr, black e, schwartz js, moore r, johnson bl jr, platt r; 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