Nas últimas décadas, a disseminação de bactérias patogênicas e resistentes, tornou-se uma preocupação a nível mundial. as metodologias fenotípicas e moleculares tradicionais são laboriosas, requerem muito treinamento técnico e possuem altos custos. o sistema maldi-tof/ms, metodologia emergente da espectrometria de massas aplicada à microbiologia, é utilizado na rotina como método de identificação por inoculação direta de bactérias e mostrou-se promissor na determinação precoce da relação epidemiológica de isolados. os staphylococcus spp. resistentes à meticilina (mrs) e enterococcus resistentes à vancomicina (vre) são importantes patógenos oportunistas que causam infecções relacionadas à assistência à saúde (iras). assim sendo, o nosso trabalho tem como objetivo analisar biomarcadores proteicos para estudos de identificação, resistência e variabilidade de isolados de mrs e vre. os isolados são provenientes do hospital universitário (hu/ufsc, florianópolis/sc, brasil), coletados entre abril de 2015 e março de 2016 de pacientes, profissionais da saúde, e ambiente hospitalar de cinco alas do hospital: emergência (emg), unidade de terapia intensiva (uti), centro cirúrgico (ccr), clínica médica i (cmi) e clínica cirúrgica i (cri). das 1.759 amostras coletadas, foram isolados 17 vre e 72 mrs. desses, catorze foram identificados como s. aureus resistentes à meticilina (mrsa) e quinze como e. faecium resistentes à vancomicina. nossos resultados apontam que o protocolo de maldi-tof validado neste trabalho para análises microbiológicas mostrou poder discriminatório para identificação dos isolados a nível de gênero, tanto para vre quanto para mrs, analisando-se proteínas na faixa de 2.000 a 20.000 da. para staphylococcus spp., os biomarcadores proteicos identificados permitiram uma análise robusta para identificação das espécies, mas não mostraram poder discriminatório suficiente para análises de marcadores de resistência à oxacilina e vancomicina ou de variabilidade e clonalidade. para a identificação dos staphylococcus coagulase negativa (scon) foram encontrados quatro picos exclusivos para s. sciuri resistentes à oxacilina (mrsci), quatro para s. haemolyticus resistentes à oxacilina (mrsh) e dezessete para s. warneri resistentes à oxacilina (mrsw). na tentativa de diferenciar mrsa dos mssa, foram obtidos nove picos com especificidade e sensibilidade consideráveis, mas somente dois, m/z 2302±2 da e 3073±2 da possuem valores relevantes da área sob a curva (auc) para futuras pesquisas. no caso do vre, o pico m/z 4430±3 da foi comum para todas as amostras, entretanto não foi possível identificar picos comuns para identificação das espécies nem para estudos de prospecção de resistência bacteriana. finalmente, apesar de bem estabelecido para identificação bacteriana, nossos dados sugerem cautela na interpretação dos resultados de maldi-tof/ms para estudos de resistência e variabilidade até que modelos computacionais estejam bem validados.