O gênero mycobacterium compreende aproximadamente 200 espécies, incluindo bactérias patogênicas, oportunistas e não patogênicas. as micobactérias pertencentes ao complexo m. tuberculosis são responsáveis por causar tuberculose, enquanto as micobactérias não tuberculosas podem causar micobacterioses. a identificação das espécies de micobactérias é essencial, pois fornece informações importantes sobre epidemiologia e possibilita o tratamento bem-sucedido dos pacientes. tradicionalmente, a identificação do gênero mycobacterium foi baseada nas características bioquímicas fenotípicas. no entanto, esses testes são demorados e às vezes produzem resultados ambíguos. muitos métodos foram desenvolvidos para identificação de micobactérias não tuberculosas nas últimas décadas, superando as limitações dos métodos fenotípicos convencionais. o tratamento de micobacteriose em geral é espécieespecífico, algumas espécies dentro de complexos apresentam alta resistência a antimicrobianos, assim, o poder discriminatório de cada metodologia é de fundamental importância para o sucesso do tratamento. o objetivo do presente estudo foi avaliar o poder discriminatório em nível de espécie de diferentes metodologias para identificação de micobactérias não tuberculosas, bem como, a epidemiologia de infecções por micobactérias não tuberculosas no estado de santa catarina. o projeto iniciou com um relatório que incluiu todos os isolados de micobactérias não tuberculosas associados a infecções, enviados ao laboratório de referência estadual para identificação entre 2010 e 2019. foram recuperados 58 isolados de micobactérias não tuberculosas de amostras clínicas da coleção estadual, previamente identificados no laboratório de referência, que foram caracterizados utilizando três metodologias: análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição por pcr (pcr-prahsp65), espectrometria de massa por ionização e dessorção assistida por matriz (maldi-tof ms) e sequenciamento parcial dos genes hsp65 e rpob. a pcr-prahsp65, maldi-tof ms e o sequenciamento parcial dos genes hsp65 e rpob mostraram elevado poder discriminatório de espécies de micobactérias não tuberculosas isoladas de amostras clínicas. os métodos pcr-prahsp65 e maldi-tof ms apresentaram concordância de 94,23% entre si. quando comparados ao sequenciamento parcial dos genes hsp65 e rpob, observou-se que a pcr-prahsp65 identificou corretamente 94,82% dos isolados e o malditof ms, 96,15%. o método de identificação de espécies de micobactérias não tuberculosas por maldi-tof ms se mostrou mais rápido, de maior facilidade de execução, com ótimo poder discriminatório e apresentou melhor custo-benefício para a imp