Leveduras s. cerevisiae tem sido amplamente utilizadas em diversos processos industriais como a produção de bebidas alcoólicas, etanol combustível e alimentos graças a sua capacidade de fermentar açúcares eficientemente, mesmo em condições industriais. no brasil, o etanol combustível é produzido a partir da fermentação do caldo de cana de açúcar ou melaço, contendo altas concentrações de sacarose. a principal vai de utilização da sacarose pela levedura s. cerevisiae é através da hidrólise extracelular do açúcar, pela ação da enzima extracelular (codificada pelos genes suc), gerando monômeros de glicose mais frutose no meio de fermentação. entretanto, a hidrólise extracelular do dissacarídeo apresenta algumas desvantagens, pois contribui para incrementar o estresse osmótico das células, além de que os monossacarídeos liberados no meio podem servir de fonte de carbono para microrganismos contaminantes do processo fermentativo. já foi descrito uma via alternativa de utilização da sacarose por s. cerevisiae, que consiste no transporte ativo deste dissacarídeo pelo simporte com prótons h+ mediado pelo transportador agt1, e posterior hidrólise intracelular pela ação de hidrolases como a invertase intracelular ou α-glicosidases. esta via de utilização de sacarose é uma alternativa interessante, pois as células fermentariam a sacarose com maior eficiência para compensar o gasto energético do transporte do açúcar, gerando mais etanol. no presente trabalho, a levedura industrial diplóide cat-1, isolada de dornas de fermentação, foi modificada genomicamente de forma a utilizar a sacarose somente por meio do transporte ativo e hidrólise intracelular. para tal fim, foram construídas leveduras que expressassem constitutivamente a forma intracelular da invertase (padh1::isuc2) sem expressar a invertase extracelular (por exemplo através da deleção da segunda cópia do gene, suc2Δ), além da sobre-expressão do gene agt1, característica indispensável para o funcionamento da via proposta. com estas modificações inseridas nas leveduras industriais gmy08 e gmy15 foram obtidos incrementos na produção de etanol de aproximadamente 13%, redução de 50% na formação de glicerol, além de não haver o acúmulo de glicose e frutose no meio de fermentação. para a aplicação direta das leveduras modificadas na indústria, foi necessário remover os marcadores heterólogos, submetendo as leveduras a diversos eventos de transformação e remoção de plasmídeos, que culminaram numa diminuição de 30% na atividade invertase intracelular. por outro lado, a seleção de clones em meio rico contendo sacarose e antimicina a, fez com que a atividade de transporte de sacarose aumentasse 4 vezes em relação às linhagens parentais. estas linhagens geneticamente modificadas sem marcadores (gmywo) apresentaram um fenótipo de utilização lenta da sacarose, porém com um maior rendimento na conversão de substrato a etanol em relação a linhagem parental cat-1. também não foi observada secreção de glicerol, nem a presença de glicose e frutose extracelular. estas leveduras geneticamente modificadas sem a presença de genes marcadores heterólogos poderão ser utilizadas para testes com mostos e condições industriais, como sistemas fermentativos de batelada alimentada com reciclo de células, contribuindo para aumentar a eficiência deste setor industrial.