As enterobactérias são patógenos oportunistas responsáveis por cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias. além disso, têm se tornado um desafio no tratamento de doenças infecciosas, principalmente em hospitais, devido à facilidade com que adquirem genes de resistência. a produção de ?-lactamases de espectro estendido esbl) é o mecanismo de resistência mais importante das enterobactérias. dentre as diversas esbls descritas na literatura, as do tipo tem, shv e ctx-m são as mais disseminadas mundialmente. o objetivo deste estudo foi avaliar por meio de métodos fenotípicos e genotípicos, o perfil de resistência de estirpes de escherichia coli, klebsiella pneumoniae e enterobacter spp. produtoras de esbl isoladas de pacientes internados no hospital universitário professor polydoro ernani de san thiago. foram identificadas 145 amostras isoladas de sangue, urina, secreção traqueal e de ferida cirúrgica de pacientes internados. foram realizados testes de suscetibilidade aos antimicrobianos e detecção fenotípica de esbl pelo teste de disco aproximação. a pesquisa genotípica de esbls foi feita para os genes blatem, blashv e blactx-m por duas reações de pcr multiplex. e a identidade dos produtos amplificados de cada gene foi confirmada por sequenciamento. a avaliação da similaridade genética entre os isolados foi realizada por meio de rapd-pcr. do total de isolados, foram identificados 66,9% de e. coli, 25,5% de k. pneumoniae, 4,1% de enterobacter cloacae e 3,4% de enterobacter aerogenes. além disso, 73% das amostras de urina foram de e. coli, 22% de k. pneumoniae, 1,7% de e. cloacae 3,4% de e. aerogenes. das amostras de sangue 57,1% foram de e. coli, 28,6% de k. pneumoniae, 7,1% de e. cloacae e 7,1% de e. aerogenes. e de ferida, 25% dos isolados foram de e. coli, 50% de k. pneumoniae e 25% de e. cloacae. a prevalência de esbl nos isolados foi de 27,6%, sendo que 32,5% dos isolados foram de e. coli, 60 % de k. pneumoniae e 7,5% de e. cloacae. o gene blatem foi detectado em 82,5% (33) das amostras, blashv 60% (24) dos isolados e blactx-m em 42,5% (17), 17,5% (7) e 12,5% (5) para ctx-m grupo 1, grupo 2 e grupo 9, respectivamente. além disso, 77% dos isolados esbl positivos expressavam mais de uma enzima. o sequenciamento confirmou a identidade de todos os produtos amplificados. na genotipagem por rapd, as amostras de k. pneumoniae foram mais semelhantes entre si que os isolados de e. coli, e duas das três estipes de e. clocae possuíam o mesmo perfil eletroforético. entretanto, apesar de algumas diferenças pontuais, a maioria dos isolados foram classificados pelo menos como “possivelmente relacionados” segundo os critérios de tenover. portanto, com os resultados obtidos nesse estudo, sugere-se a existência de uma estirpe de k. pneumoniae endêmica no hu/ufsc, disseminada por todos os setores, situação semelhante à observada com as estirpes de e. coli.