O papilomavirus humano (hpv) e chlamydia trachomatis (ct) são responsáveis pelas doenças sexualmente transmissíveis, de origem viral e bacteriana, mais prevalentes na população sexualmente ativa. o hpv desempenha papel central na etiologia de praticamente todos os casos de câncer cervical, entretanto, admite-se que outros fatores possam, conjuntamente com o vírus, modular o risco de transição da infecção cervical para a malignidade. além do hpv, diversos estudos estão considerando a ct como um cofator no desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais cervicais e outras alterações celulares significativas em mulheres com histórico de infecção por hpv. diante disto, o objetivo deste estudo foi estimar a prevalência de hpv, ct e a coinfecção hpv/ct por métodos moleculares (pcr-multiplex, microarray, rflp e sequenciamento) em amostras cervicais de mulheres atendidas no sistema único de saúde da cidade de são miguel do oeste/sc. trata-se de um estudo transversal, cujo desfecho é a positividade ao hpv e à ct. durante o período de novembro de 2011 a março de 2013, foram coletadas amostras cervicais de 325 mulheres sexualmente ativas e que procuraram o serviço de saúde para rastreio rotineiro do câncer cervical. as amostras foram submetidas à pcr-multiplex padronizada neste estudo, utilizando os conjuntos de iniciadores pgmy0911, ctp1/ctp2 e pco3/pco4. as amostras positivas para hpv foram submetidas à técnica de pcr-rflp (polimorfismo dos fragmentos de restrição), microarray e sequenciamento. a prevalência do dna de hpv foi de 24,6% na amostra estudada. já em relação à ct a prevalência foi de 11,1% e 4,6% da amostragem total, apresentando coinfecção para hpv/ct. observou-se associação do hpv com as seguintes variáveis: citologia (p<0,001), idade (p=0,001), idade de início da atividade sexual (p= 0,008) e o uso de anticoncepcional oral (p=0,048). encontrou-se associação entre a ct e o número de parceiros ao longo da vida (p=0,048). observou-se associação entre as variáveis: idade (p=0,006) e uso de anticoncepcional oral (p=0,011) com a presença da coinfecção hpv/ct. a genotipagem das amostras pelas três metodologias (rflp, sequenciamento e microarray) identificou 32 genótipos diferentes de hpv, dentre eles o 16, 39, 53, 68 e 56 foram os mais prevalentes. a pcr-multiplex, padronizada neste estudo, mostrou-se útil no rastreio simultâneo do hpv e da ct, assim como a metodologia pcr-rflp apresentou um bom desempenho para a identificação concomitante de até dois tipos de hpv em uma mesma amostra. o sequenciamento mostrou-se uma excelente ferramenta para a identificação de infecções por um único tipo viral, enquanto o papillocheck® foi o método capaz de detectar amostras polinfectadas. a pcr-multiplex associada a pcr-rflp pode ser utilizada como um método de rastreio e identificação de genótipos de hpv em infecções simples ou como discriminatório entre infecções simples ou múltiplas, enquanto que a análise por uma metodologia com maior poder discriminatório, pode ser utilizada como método complementar, principalmente em locais com poucos recursos financeiros. embora a sensibilidade do rflp tenha sido inferior ao desejável para a maioria dos tipos virais, o alto valor preditivo negativo desta metodologia define sua utilidade no rastreio do hpv, visto que resultados negativos em metodologias com elevado valor preditivo negativo são confiáveis.