Na mastite bovina, doença caracterizada pela inflamação da glândula mamária, a aplicação de antimicrobianos é o tratamento preconizado. entretanto, o uso indiscriminado tem consequências negativas ao meio ambiente e a saúde pública. desta forma, é crescente a busca por métodos alternativos de controle, como pelos produtos naturais, os quais podem também ser utilizados por sistemas orgânicos que possuem restrições quanto à utilização de fármacos. diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar in vitro o potencial de extratos hidroalcoólicos de bidens pilosa, reconhecidos por diversas atividades biológicas, no tratamento da mastite bovina. para isso, buscou-se otimizar as condições de extração hidroalcóolica, i.e., tempo de extração (4 h, 48 h e 7 dias) através da determinação do perfil químico e das atividades antimicrobiana, antibiofilme e citotoxicidade. nos extratos preparados com 4 e 48 h (eb-4 e eb48, respectivamente) os teores de fenólicos e flavonoides totais foram superiores ao encontrado no extrato obtido com 7 dias (eb-7). as atividades antioxidantes pelo método de captura do radical ddph dos extratos eb-4, eb-48 e eb-7 foram 80%, 79% e 56%, respectivamente, estando fortemente correlacionadas ao teor de fenólicos e flavonoides totais (acima de 0,87%). a análise dos extratos por cromatografia líquida de alta eficiência (clae), após fracionamento utilizando a extração em fase sólida (efs), revelou que os flavonóis eram o grupo majoritário para os extratos eb-4 e eb-48 e os ácidos fenólicos para eb-7. a despeito das diferenças encontradas no perfil químico, os três extratos mostraram atividade antimicrobiana similar, com uma concentração inibitória mínima (cim) em torno de 0,3 mg/ml. a ic50 no ensaio de citotoxidade para o extrato eb-4 frente às células mac-t foi 0,156 mg/ml, i.e., cerca da metade do valor da cim. além disso, o extrato eb-4 promoveu 100% da inibição da formação e erradicação de biofilme pré-formado na concentração de 2 mg/ml. os resultados encontrados evidenciaram o potencial dos extratos de b. pilosa, uma espécie invasora de fácil disseminação, no tratamento da mastite bovina causada por s. aureus, principalmente devido a atividade antimicrobiana e antibiofilme. entretanto, devido a toxicidade moderada, sugere-se a realização de novos estudos de incorporação do extrato em sistemas nanoemulsionados visando o desenvolvimento de um novo produto para o tratamento da mastite bovina, especialmente e para os sistemas de produção sustentáveis, i.e., orgânico ou agroecológico.