Resumo as leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de pessoas e constituem um problema de saúde mundial. faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias para o estudo de novas entidades quimicas ativas contra a doença e que sejam menos laboriosas, mais rápidas, sensíveis e compatíveis com a automação. no presente trabalho, realizou-se a transfecção de forma integrativa do gene da ?-galactosidase em três espécies de leishmania (l. (l.) infantum, l. (v.) braziliensis e l. (l.) amazonensis) com o objetivo de padronizar um ensaio colorimétrico rápido e sensível para triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de l. (v.) braziliensis. a transfecção dos parasitos não alterou suas características biológicas avaliadas pelo crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade para células thp-1 e para camundongos balb/c em nenhuma das cepas transfectadas. a atividade da enzima medida através de ensaio colorimétrico mostrou correlação direta entre a leitura e o número de parasitos. a expressão da enzima foi estável nas linhagens selecionadas, mesmo na ausência da pressão do antibiótico de seleção, indicando a integração do gene que foi confirmado através de pcr. ensaios de atividade enzimática utilizando promastigotas mostraram um limite inferior de detecção de 780 parasitos por cavidade, permitindo a determinação da atividade enzimática em amastigotas intracelulares. a transfecção em l. (v.) braziliensis não alterou a susceptibilidade aos fármacos leishmanicicas de uso clínico: anfotericina b e miltefosina. contudo, o processo de transfecção provocou a resistência dos parasitos aos fármacos paromomicina e glucantime, 3 a 10 vezes acima da ic50 da cepa parental. os resultados obtidos pela metodologia colorimétrica foram semelhantes aos obtidos pela metodologia clássica de contagem através de microscopia, pasronizando assim o ensaio.